基于qPCR和LAMP技术的马铃薯晚疫病菌快速检测方法

马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 ^-6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。     

利用MAS技术改良香稻‘R15’的直链淀粉含量

R15是适应性较广,产量较高的中熟晚籼香稻品系,但由于含有Wx^a基因,其直链淀粉含量高达23.5%,严重影响食用口感。因此,我们以含有Wx^b等位基因的不育系Y58S为供体,通过杂交、回交,利用RAD测序技术、分子标记辅助筛选等技术,经过8个世代的筛选,成功用Wx^b基因替换掉R15中的Wx^a基因,培育出1个新的纯合株系——‘深华R16’,其染色体上有10882234 bp长度的碱基,基因型和供体亲本‘Y58S’一致,占2.92%;有362363285 bp长度的DNA片段基因型和受体亲本‘R15’一致,占97.08%;其直链淀粉含量为14%。将‘Y58S’分别与‘深华R16’和‘R15’进行组配,结果表明,‘Y58S’/‘深华R16’组合的直链淀粉含量(13.9%)低于‘Y58S’/‘R15’组合的直链淀粉含量(19.9%),其它米质性状与农艺性状基本一致。本研究为分子标记辅助育种提供了新思路,培育出一新的水稻品系。     

玉米Reid种质DH系遗传分析

为探讨玉米Reid种质遗传改良效果,本研究以Reid类群重要种质J1491、J1492、J1493、J1495、J1498与PH6WC构建基础群体,通过DH技术育成DH系,经鉴定从中选取5个代表DH系6DH6、6DH7、6DH9、6DH10、6DH12作母本,以Non-Reid群5个优良自交系作父本,按NCII设计组配25个杂交组合,对DH系单株产量及其构成因素的杂种优势、配合力和相关方面进行了研究。结果表明,单株产量杂种优势以组合6DH7×J1628最高为180.22%,组合6DH12×J1673最低为54.94%;单株产量一般配合力效应值最高的有6DH7和6DH10,穗长、穗粗亦为正效应,因此认为6DH7和6DH10更具应用潜力;特殊配合力效应值最高的组合是6DH7×J1673。各产量性状中穗长、穗粗和秃尖长,狭义遗传率高,主要以基因加性效应为主。本研究为鉴定有潜在价值的DH系及杂交种提供选择,为玉米遗传改良提供参考。     

甜玉米(Zea mays L.saccharata Sturt)含糖量与主要农艺性状的相关及通径分析

为选育含糖量高的甜玉米品种,本试验对甜玉米含糖量与主要农艺性状进行相关性分析。结果表明,含糖量与穗长、株高、穗位呈正相关,与单穗重、秃尖长、穗粗、穗行数、行粒数、轴重、轴粗、百粒重、茎粗呈负相关。在实际选择中可以参考这些性状来选择含糖量高的甜玉米。为了更加清楚地了解各主要农艺性状和含糖量之间的直接效应和间接效应,对此进行通径分析,结果表明,各农艺性状对含糖量的通径系数顺序为穗长>株高>轴重>穗位>单穗重>穗粗>茎粗>行粒数>穗行数>百粒重>轴粗>秃尖长>皮渣率。本研究为今后选育含糖量高的甜玉米品种提供了重要的参考依据。     

冬瓜杂种种子纯度鉴定的SSR分析

种子纯度是种子质量的核心指标,目前冬瓜、节瓜杂种优势已被广泛地应用于生产。探索出一种快速、准确的冬瓜、节瓜品种纯度鉴定方法是确保种子质量的技术保证,也是品种纯度检测实现商业化的前提。本研究以‘绿优’冬瓜和‘梅花8号’节瓜及其各自亲本为试验材料,利用SSR分子标记技术对亲本及杂种之间的多态性进行分析。结果显示,从200对SSR引物中筛选出2对多态性引物scaffold4775和scaffold5674,用于‘绿优’冬瓜和‘梅花8号’节瓜杂种种子纯度的鉴定。其扩增片段电泳条带清晰可辨,杂交种中呈现双亲的互补带型,SSR标记表现出稳定的显性和共显性,能将‘绿优’冬瓜和‘梅花8号’节瓜与其父母本区分开来。分子检测平均纯度均为98%,田间纯度鉴定分别为98%和99%,结果基本一致,表明引物scaffold4775和scaffold5674可用于‘绿优’冬瓜和‘梅花8号’节瓜的纯度鉴定。SSR分子标记呈现出经济快速、准确等特点,在冬瓜、节瓜品种纯度鉴定上其应用前景十分广泛。     

vvi-miR160s介导VvARF18应答赤霉素调控葡萄种子的发育

【目的】研究vvi-miR160家族（vvi-miR160s）及其靶基因在‘魏可’葡萄种子发育过程中的作用,探究其应答赤霉素（GA）调控葡萄果实无核的潜在机理。【方法】采用miR-RACE、生物信息学分析、RT-qPCR、RLM-RACE等方法,鉴定vvi-miR160家族成员及其靶基因,分析vvi-miR160s及其靶基因应答GA的时空表达模式及其潜在功能。【结果】花前GA处理强烈抑制‘魏可’葡萄胚珠及种子发育,高效诱导其无核,且无核率达99.8%。克隆鉴定了VvMIR160s前体基因序列（501 bp）及成熟体序列,且它们在不同物种间具有较高的保守性;基于vvi-miR160s序列,预测到靶基因VvARF18,利用RLM-RACE技术检测到vvi-miR160s对VvARF18的裂解位点在第10和第11位之间,裂解频度9/17,证明VvARF18是vvi-miR160s的真实靶基因。该靶基因编码683个氨基酸,在398—411位存在核定位信号,且该蛋白亚细胞定位于细胞核上。VvARF18与其他物种间序列的同源保守性较高,基因结构相似,其中VvARF18蛋白与茶、烟草、梅花等物种亲缘关系较近。VvARF18启动子中包含4种作用元件,且含有较多激素相关元件。RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,vvi-miR160c/d/e呈现‘V’形表达趋势,在硬核种子发育期表达较低,而VvARF18表现出与前者相反的表达趋势,在硬核种子发育期呈现高表达,表明vvi-miR160c/d/e对VvARF18负调控,但vvi-miR160a/b与VvARF18表达水平却不存在明显负相关。GA处理极显著地上调了vvi-miR160a/b在葡萄硬核种子发育期的表达,同时也显著抑制了VvARF18在同时期的表达,且它们的表达水平呈负相关,表明GA处理促进了vvi-miR160a/b对VvARF18的负调控作用;相反,GA减弱了vvi-miR160c/d/e对VvARF18的负调控作用。【结论】在vvi-miR160家族中,vvi-miR160c/d/e可能介导VvARF18在葡萄种子发育的特定阶段调控种子的发育形成,而vvi-miR160a/b可能主要介导VvARF18参与调控GA诱导葡萄种子败育的过程。     

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

【目的】肉鸡胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡常见的一种骨骼性疾病,研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响,为治疗TD提供新的思路和方法。【方法】将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮对照组,D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD,在添加福美双第1、3、5、7天,腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液,A组与D组注射（100 μg·kg ^-1）磷酸盐缓冲液;B组与E组注射低剂量（100 μg·kg ^-1）GSTA3;C组与F组注射高剂量（200 μg·kg ^-1）GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平,利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。【结果】Real-time qPCR结果显示,TD损伤修复期内,相比较于基础日粮对照组,福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（P<0.05）;相比较于福美双对照组,E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异,且在第10和15天显著低于福美双对照组（P<0.05）,表明与D组相比恢复较快。免疫组化结果表明BAG-3蛋白在肉鸡胫骨软骨细胞的增殖区和前肥大区无表达,只在肥大区细胞质中表达;福美双组与空白对照组相比,BAG-3蛋白表达增加;福美双高低剂量组与未注射蛋白的福美双组相比,重组GSTA3增加了肥大区的蛋白表达水平（第10和15天）。【结论】在福美双诱导肉鸡发生TD的过程中,GSTA3重组蛋白能够通过调控BAG-3表达参与凋亡途径,抑制细胞凋亡。在TD损伤修复期,注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表达增强,从而可参与细胞凋亡来缓解TD损伤,使得肉鸡TD生长板功能较快地恢复正常。     

基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】 以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】 用Primer Premier 5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】 200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A（50%）和T（50%）。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种（AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少）。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种（GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少）。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67（平均2.07）、1.33—4.33（平均2.73）和0.67—4.00（平均1.83）。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间：0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17（21.25%）、36（45.00%）、11（13.75%）、14（17.50%）和2个（2.50%）。就$\overline{\text{Rp}}$值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67（平均0.51）、0.40—0.78（平均0.59）和0.33—0.83（平均0.59）。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.2000）,其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.5333）,其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.4727）,其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355（平均0.4293）、0.2392—0.7438（平均0.4293）和0.2392—0.7438（平均0.3989）。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776（平均0.7497）、0.5623—1.0986（平均0.8339）和0.5623—1.0889（平均0.8312）。【结论】 基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对（88.5%）可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。     

水稻温敏型叶片白化转绿突变体tsa2的表型鉴定与基因定位

水稻温敏型叶色突变体是研究植物光合作用、叶绿体结构和功能以及温度影响叶绿体发育的理想材料。利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼型水稻(OryzasativaL.)三系保持系西农1B,从其后代中筛选到一个突变性状稳定遗传的温敏型叶片白化转绿突变体tsa2 (temperature-sensitive green-revertible albino 2)。与野生型相比, tsa2突变表型受温度影响, 22°C条件下萌发的野生型幼苗表型正常,而tsa2幼苗完全白化,且约40%白化苗死亡,存活白化苗的光合色素含量、光合速率均显著降低,成熟期主要农艺性状均显著变劣;在28°C下萌发的tsa2幼苗叶片呈浅绿色并伴有白条纹,其光合色素含量显著降低,光合速率及主要农艺性状差异较小; 32°C下萌发的tsa2幼苗叶片无明显差异。透射电镜观察显示,与野生型相比,tsa2在22°C下叶肉细胞中无叶绿体或存在异常发育叶绿体(尚未分化出基粒和基层),在28°C下部分叶肉细胞含少量发育完整的叶绿体,在32°C下叶肉细胞数量及形态均正常。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,与野生型相比,tsa2突变体中部分光合色素代谢途径基因、叶绿体发育相关基因及光合作用相关基因的表达水平呈不同程度变化。遗传分析表明, tsa2突变表型受一对隐性核基因控制, TSA2被定位于第5染色体SSR标记S5-57和S5-119之间,物理距离为718 kb。本研究为水稻遗传改良及研究温度影响叶绿体发育机制奠定了基础。